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实验报告2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

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  实验报告 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)测定蛋白质的分子量 1 原理 1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理 1.1.1 性能 聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好,有弹性,透明,相对地化学稳定,对 pH 和温度变化比较稳定,在很多溶剂中不溶,是非离子型的,没有吸附和 电渗作用。通过改变浓度和交联度,可以控制孔径在广泛的范围内变动, 并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性,因此还适于少量样品的 制备,不致污染样品。 1.1.2 制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合 和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫 酸铵(AP)或过硫酸钾,此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂,最有效的 加速剂是 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 。在叔胺的催化下,由过硫 酸铵形成氧的自由基,后者又使单体形成自由基,从而引发聚合反应。叔 胺要处于自由碱基状态下才有效,所以在低 pH 时,常会延长聚合时间; 分子氧阻止链的延长,妨碍聚合作用;一些金属也能抑制聚合;冷却可以 使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在 1 小时内完成,以便使凝胶 的性质稳定。 1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系 凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品 时,常先用 7.5%的标准凝胶或用 4~10%的凝胶梯度来试测,而后选出适宜的凝胶 浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要,胶太软易断裂, ;太硬则 脆,也易折断。 1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理 蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于所带净电 荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS 和 巯基乙醇,则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷 和形状无关。 在蛋白质溶液中加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中 的二硫键还原;SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分 子上, 形成蛋白质-SDS 复合物。 SDS 与蛋白质的结合带来两个后果: 第一, 使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,掩盖了不同种类蛋 白质间原有的电荷差别,使所有的 SDS- 1 蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷/蛋白质比向正极移动;第二, SDS 与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响, 而只是蛋白质分子量的函数。 选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物,使 其形成 SDS 复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离,分子量小 的物质泳动距离大,分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率,用 相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图,它们在一定范围内呈直线关系。 因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。 1.3 染色原理 常用的染料主要有氨基黑 10B、 考马斯亮蓝 R250、 考马斯亮蓝 G250、 1-苯胺基-8-萘磺酸,各有优缺点,本实验选用考马斯亮蓝 R250,它的染色 灵敏度比氨基黑高 5 倍,尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。 2 试剂与器材 2.1 试剂 2.1.1 (1 号液)凝胶贮备液 丙烯酰胺(Acr) 甲叉双丙烯酰胺(Bis) 加蒸馏水至 29.2 g 0.8 g 100 mL 2.1.2 (2 号液)浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 6.8) 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 6g 加蒸馏水约 50 mL,溶解后以 6mol/L HCl 调到 pH 6.8, 定容至 100 mL 2.1.3 (3 号液)分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.8) 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 加蒸馏水 溶解后以 6mol/L HCl 调到 pH 8.8 18.15 g 约 50 mL 加蒸馏水至 2.1.4 100 mL (4 号液)10% 十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液 1.0 g 10.0 mL (5 号液)过硫酸铵(APS)溶液 SDS* (电泳用) 蒸馏水 2.1.5 2 过硫酸铵 1.0 mL 临用前配置 2.1.6 2.1.6 Tris 14.4 g 4 号液 至 2.1.5 2 号液 4 mL 甘油 1 mL 0.04% 溴酚蓝 2.1.9 染色剂 样品缓冲液 1 000 mL 100 mg 蒸馏水 (6 号液)N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 电泳缓冲液 3 g 甘氨酸 10ml 加蒸馏水 0.5 mL 4 号液 2 mL β -巯基乙醇 0.5 mL 加水至 10mL 考马斯亮蓝 R250 125mL 乙酸 100mL 2.1.10 脱色剂 0.31g 甲醇 25mL 蒸馏水 甲醇 50mL 蒸馏水 2.1.11 保存液 7%乙酸水溶液 2.1.12 SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质 250mL 乙酸 200mL 蛋白质名称 97400 牛血清白蛋白 分子量(MW) 兔磷酸化酶 B 66200 43000 兔肌动蛋白 3 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 2.2 器材 31000 20100 14400 电泳仪,垂直板电泳槽,酸度计,电导仪,分析天平,真空泵,高速 台式离心机,微量加样器,染色槽,电炉。 3 实验步骤 3.1 制备电泳分离胶 根据样品分子量的大小,配制所需浓度的分离胶。10~100 K 分子量的 样品,宜采用 T=12%的胶,40~200 K 分子量的样品宜采用 T=7.5%的胶。本 实验采用 T=10%的胶,具体配方如下: 分离胶: 1 号液 10mL 3 号液 4 号液 蒸馏水 6 号液 5 号液

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