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36选7SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量_化学_自然科学_专业资料。SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 生化社团 吕炎 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量 ? 一、实验目的 ? 二、实验原理 ? 三、实验步骤 ? 四、结果分析 ? 五、注意事项 一、实验目

  SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 生化社团 吕炎 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量 ? 一、实验目的 ? 二、实验原理 ? 三、实验步骤 ? 四、结果分析 ? 五、注意事项 一、实验目的 ? 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测 定蛋白质分子量的原理。 ? 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的 操作技术。 二、实验原理 ? SDS的性质与作用 ? 聚丙烯酰胺凝胶的性质 SDS的性质与作用 十二烷基磺酸钠(SDS) SDS的性质与作用 Sodium dodecyl sulphate CH3-(CH2)10-CH2OSO3--Na+ Protein Strand - - Denature SDS Molecules - - - SDS的性质与作用 ? 蛋白质变性 ? 0.1-1% SDS ? 0.1 M 2-巯基乙醇 ?蛋白质变与SDS分子按比例结合 ? 1 :1.4 SDS 聚丙烯酰胺凝胶性质 ? 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由丙烯酰胺(Acr) 和甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂的作用下, 聚合交联而成的。 聚丙烯酰胺凝胶性质 ? 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)具有三维网状结构,能 起分子筛作用。用它作电泳支持物,对样品 的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子 大小。 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)还具有浓缩效应, 即在电泳开始阶段,由于不连续pH梯度作用, 将样品压缩成一条狭窄区带,从而提高了分 离效果。 PAGE和SDS-PAGE的比较 PAGE SDS-PAGE X- -Y Z + SDS X + Y Z - + 结果受分子量大小和电荷的影响 结果只与分子量大小有关 三、实验步骤 ?制备分离胶 ?制备浓缩胶 ?电泳及染色 ?凝胶板剥离与染色 配制分离胶溶液 ?制备分离胶 H2O 30%Acr Buffer 10%SDS 10%Ap TEMED 分离胶(10%.5ml) 1.4ml 1.7ml 1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.8ml 0.05ml 0.05ml 5?l 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入。 注胶过程要一次性完成,避免产生气泡。 封水或饱和 正丁醇溶液 出倒现出明水显或界正面丁时醇, 分并离用胶滤凝纸聚吸完干成 ( 30min~1h) ?制备分离胶 加入分离胶溶 液 pH 8.8 封水的目的是使分离胶上表面平直,并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 配制浓缩胶溶液 ?制备浓缩胶 H2O 30%Acr Buffer 10%SDS 10%Ap TEMED 浓缩胶(5%.3ml) 0.7ml 1.5ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 0.03ml 0.03ml 4?l 插入样品梳 加入浓缩胶溶 液 pH 8.6 分离胶 pH 8.8 样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。 ?制备浓缩胶 通电 加入电极缓冲 液pH 8.3 加入样品 ?上样及电泳 浓缩胶 pH 8.6 开始电流恒定在10mA,当进入分离胶后改为20mA, 溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳。 分离胶 pH 8.8 凝胶板剥离与染色 ? 电泳结束后,撬开玻璃板,将凝胶板 做好标记后放在大培养皿内,加入染 色液,染色1小时左右。 ? 脱色:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗 数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质 区带清晰。 ? 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色 要充分. 影响电泳速度的外界因素 ? 1.电场强度 ? 2.溶液的pH值 ? 3.溶液的离子强度 ? 4.电渗现象 ? 5.温度的影响 ? 6.支持物的影响 四、结果分析 蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 ( c m ) 相 对 迁 移 率 = 溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 ( c m ) 以每个蛋白标准的分子量对 数对它的相对迁移率作图得标 准曲线,36选7!量出未知蛋白的迁移 率即可测出其分于量。36选7 标难曲线只对同 一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。 五、注意事项 ? 1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于 皮肤,操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑 料手套操作。 ? 2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯 酰胺的聚合反应,故一定要新鲜,贮存过久的过硫酸铵商品 不能使用。此外,10%过硫酸铵必须现用现配,4℃冰箱贮存 不超过48小时。 ? 3.灌制凝胶时,应避免产生汽泡,因为汽泡会影响电泳分离 效果。 ? 4.刚灌注分离胶混合溶液后,应在分离胶液面上加1—2cm高 的水层,以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心,缓缓 叠加,以免冲坏凝胶的胶面。 ? 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长,电泳过程中产热多,特别是 夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量, 或在4℃冰箱中电泳。

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